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农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法(十二)

 
 


(7)免疫测定的质量控制

1.准确度:通过标准加入恢复测试评估准确度。回收率一般应达到70%至120%。

2,精密度:在酶联免疫吸附试验中,通常使用批内误差和批间误差来表示精确度。重复性试验的相对标准偏差(RSD),样品中样品含量小于1×10-6 mg/kg时的相对标准偏差≤12.5%0,含量为1时相对标准偏差小于1×10-7毫克/千克。当含量小于1×10-8 mg/kg时,相对标准偏差≤100%≤25%。

3.灵敏度:灵敏度是指待测方法的最小检测量或最小检测浓度。在酶联免疫吸附测定中,可以确定空白“0”管的吸光度值。测定10个以上的“0”管,测定吸光度的平均值(X),减去相对标准偏差(RSD),从标准曲线求出与吸光度值X 2RSD对应的浓度。 。这是灵敏度。当吸光度值被抑制20%作为定量检测的下限时,大多数研究人员使用分析物浓度(IG20)。

4.方法的特异性:免疫测定方法的特异性取决于抗体的特异性。含有与样品中分析物相似结构的物质可能会发生交叉反应并导致高测量结果,从而导致误报。通常使用评估抗体与其他结构类似物的交叉反应速率的方法的特异性。在酶联免疫吸附测定中,结构类似物的交叉反应速率可通过下式计算。

交叉反应速率=目标分析物的模拟类似物/IC50的IC50×100%

其中IC 50是结构类似物或靶分析物的浓度,其中在酶联免疫吸附测定中产生50%的酶促显色抑制。通常,2%至10%的交叉反应速率将对目标分析物的测定结果的准确性产生一定影响。

5.验证分析:免疫分析使用生化试剂(抗体和酶),样品基质成分复杂,分析结果易受许多不确定因素的影响。因此,对于新建立的免疫分析方法和可疑分析结果,应使用现代仪器分析方法,如气相色谱(GC),高效液相色谱(HPLC),气相色谱质谱(GG MS),高效液体。通过相色谱质谱仪(HPLDMS)进行相关性验证分析。(8)免疫分析在农药残留分析中的应用

自20世纪80年代以来,免疫检测在农药残留检测中的应用越来越受欢迎。其中,酶联免疫吸附试验(ELISA)是农药残留最活跃的指标,主要是食品(如水果,蔬菜,啤酒,饮料,肉类)。环境样品中的农药残留物如鱼,牛奶,植物油,蜂产品,豆类,谷物和加工产品以及水和土壤是主要目标。许多发达国家投入了大量资金在该领域开展研究。大量文献报道了建立ELISA,杀虫剂,除草剂和一些植物(昆虫)生长调节剂酶联免疫吸附试验方法。检测水平可达到ng甚至pg水平。一些发达国家(如美国,德国)已开发出多种商业农药残留免疫检测试剂盒,如美国某公司开发的试剂盒可检测杀虫剂,如毒死蜱,甲基毒死蜱,嘧啶磷,磷酸盐,毒死蜱,氯丹,滴滴涕,毒杀芬,硫丹,六氯环己烷,二嗪农,甲氧普林,涕灭威,呋喃丹,尼古丁等.2,4-D,尿素除草剂,三嗪除草剂,cyanazine,alachlor,acetochlor,chlorsulfuron,metsulfuron,paraquat,grass,有苯菌灵,甲霜灵,噻苯达唑,腐霉利等。美国环境保护局(EPA),农业部食品安全和检验部(FSIS-LISI)和美国分析化学家协会(AOAC)已经制定了农药残留免疫检测试剂盒的评估和许可指南。

中国的农药免疫分析化学研究始于20世纪90年代初,建立了有机磷(对硫磷,甲基对硫磷,三唑磷等),氨基甲酸酯(Cape Budweiser,Carbaryl,速度免疫,如拟除虫菊酯(氰戊菊酯,氯氰菊酯,氰戊菊酯,溴氰菊酯等)。 。)和一些其他农药(烯效唑,多菌灵,2,4-丁酸等)分析技术,但商业农药免疫检测试剂盒仍然很少。

四是农药免疫分析技术的发展趋势

免疫测定技术的基础是抗原体反应。我对靶分析物具有高亲和力的特异性抗体是建立免疫分析技术的基础。抗体的本质是免疫球蛋白。制备具有高稳定性和特殊功能的抗体是免疫测定化学研究的目标之一。免疫应答的特异性决定了农药免疫测定主要针对单一靶分析物。在建立免疫化学技术的同时,对不同结构的农药进行定性和定量检测仍存在一些技术瓶颈。因此,农药免疫分析化学的主要发展方向包括基因工程抗体的研究和多组分免疫分析技术的研究。(1)具有优异特性的基因工程抗体

1.具有特殊性质的抗体:将具有特殊性质的基因(例如耐酸,碱,热和有机溶剂的基因)引入抗体基因并表达以获得耐酸碱性,耐热性和抗性。抗体的特殊性质,如有机溶剂。

2.双特异性抗体:使用基因工程技术,将不同抗原结合位点的基因重组到同一抗体基因中并表达,并且一个Fae末端与待测抗原结合,另一个Fab末端与标记结合。抗体,因此不需要标记抗原和抗体。

3.具有酶催化功能的抗体:将具有酶催化功能的基因(例如过氧化物酶基因)导入抗体基因并表达以获得具有免疫活性和酶功能的抗体,从而使用酶免疫测定法和消除酶标记工作。

(二)多组分免疫分析技术研究

因为抗体以高特异性结合抗原,所以免疫测定主要针对某种物质或某种类型的结构类似物。在实际分析中,同时测定许多不同的结构物质总是重要且有吸引力的。因此,建立能够同时定性检测和定量检测各种结构农药等小分子化合物的免疫分析技术已成为当前研究的热点之一,具有重要的理论和实际意义。

1.现有的多组分免疫测定方法

(1)多探针标记免疫分析:不同类型的标记(如荧光剂,酶,化学发光剂等)用于标记不同的抗原(包括半抗原)或抗体,免疫反应后,不同标记的信号变化是检测。由此分析多个相应的目标分析物。许多不同类型的探针标记受到标记性质和标记方法的限制,并且不同类型的标记需要不同的检测条件,并且检测手段难以兼容。

(2)多组分定位试剂盒是空间分辨免疫分析:不同的抗体或抗原固定在不同的位置,不同的抗原(或抗体)用相同的标记标记,异质免疫反应在不同的位点进行,分离和洗涤后,检测到不同的网站。该方法在每个反应点使用不同的试剂,操作复杂。(3)共同结构抗体的应用:衍生化某种目标分析农药的常见成分(如拟除虫菊酯农药的拟除虫菊酯部分),半抗原的合成,半抗原和载体蛋白的共价偶联常见的人工抗原强调了农药的结构,从而使动物免疫或利用杂交瘤技术制备针对农药的常见结构的抗体用于靶分析,并用于快速筛选和检测具有共同结构的农药,并且该方法简单。该方法的主要缺点是不能确定目标分析物的特定种类。此外,对于含有常见结构农药的不同品种,由于分子其他部分结构的差异或差异,抗体与不同品种农药的亲和力可能不同或显着不同,而且农药含量低对抗体的亲和力可能会泄露。由其他物种检查或覆盖。

2.量子点标记免疫分析技术研究

目前,开发小分子复合免疫分析技术有两条平行的途径。首先,标记的免疫分析不断改进和提高分析的可靠性和灵敏度,为分析小分子化合物提供了更准确和实用的方法。二是研究开发具有优良功能的新型免疫标记探针和免疫标记方法,开发多组分免疫分析技术的新领域。新型半导体纳米荧光材料的研究和开发利用为小分子化合物多组分免疫分析技术的研究提供了难得的机遇。

量子点是半导体晶体材料的纳米颗粒。作为新型荧光探针,与传统的有机荧光探针相比,它具有以下优异的性能:宽的激发波长,窄的发射波长和对称性,并且可以使用相同的激发光。激发具有不同粒径的多个量子点,发射不相互干扰的不同波长的荧光;量子点的荧光强度和稳定性可以达到有机荧光探针的20到100倍,并且几乎没有光褪色现象,并且标记可以是长时间观察的材料并且不容易受到干扰。生物分子或其他物质的荧光;化学修饰并在表面具有活性基团的水溶性量子点可以与生物分子有效连接并保持生物活性,并具有良好的生物相容性。荧光量子效率高;量子点的荧光发射波长与粒径有关,不同的抗体,抗原或半抗原可以用不同粒径的量子点标记。量子点标记免疫分析是近年来荧光免疫分析技术研究的一个新趋势。期望利用量子点的特殊性质来解决小分子化合物的多组分免疫测定技术的问题。参考:农药残留分析

相关链接:

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[关键词]农药残留,酶活性抑制,免疫分析,国家标准物质网络

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